細菌培養特性觀察 【材料】 1、破傷風梭菌、產氣莢膜梭菌、肉毒梭菌庖肉培養液的培養物。 2、脆弱類桿菌血瓊脂平板(含膽汁)的培養物。 3、產氣莢膜梭菌石蕊牛乳培養液和葡萄糖高層瓊脂培養液的培養物。 【操作】 1、觀察庖肉培養液中破傷風梭菌、產氣莢膜梭菌、肉毒梭菌的生長特點。 (1)破傷風梭菌在皰肉培養液生長特點：肉湯混濁，肉渣不消化，微變黑，有腐敗性惡臭。 (2)產氣莢膜梭菌在皰肉培養液上生長特點：肉渣不被消化，呈粉紅色，產生氣體。 (3)肉毒梭菌在皰肉培養液上生長特點：消化肉渣變黑，有腐敗惡臭。 2、觀察脆弱類桿菌菌落特點脆弱類桿菌在血瓊脂平板上的菌落呈圓形，光滑，灰白色。邊緣整齊。

各類食品菌落總數的標準 菌落總數是食品中重要的安全衛生指標，表示食品受細菌污染的程度。 1、膨化食品的落菌總數標準 依據國家強制性標準GB17401-2003《膨化食品衛生標準》規定，膨化食品的菌落總數應為≤10000cfu/g、大腸菌群應為≤90MPN/100g，超過國家標準規定可判斷為不合格膨化食品。 2、固體飲料的落菌總數標準 依據國家強制性標準GB7101-2003《固體飲料衛生標準》規定，固體飲料產品的菌落總數應≤1000cfu/g;大腸菌群應≤90MPN/100g;霉菌應≤50cfu/g，超過國家標準規定可判斷為不合格固體飲料。 3、糕點、面包、月餅的落菌總數標準 依據國家強制性標準GB7099-2003《糕點、面包衛生標準》規定，月餅產品中菌落總數不得超過1500cfu/g，大腸菌群不得超過30MPN/100g，霉菌計數不得超過100cfu/g;蛋糕生產的標準要求：菌落總數≤10000cfu/g，大腸菌群≤300MPN/100g，霉菌≤150cfu/g，超過國家標準規定可判斷為不合格糕點類產品。 4、食醋的落菌總數標準 依據國家強制性標準GB2719-2003《食醋衛生標準》規定，食醋中菌落總數不得超過10000cfu/mL，超過國家標準規定可判斷為不合格食醋。 5、冷凍飲品的落菌總數標準 依據國家強制性標準GB2759.1-2003《冷凍飲品衛生標準》規定，含淀粉或果類的冷凍飲品菌落總數應≤3000cfu/g,大腸菌群應≤100MPN/100g;含乳蛋的冷凍飲品的菌落總數應≤25000cfu/g,大腸菌群應≤450MPN/100g，超過國家標準規定可判斷為不合格雪糕或冷飲。 6、餅干的落菌總數標準 依據國家強制性標準GB7100-2003《餅干衛生標準》規定，非夾心餅干的菌落總數不得超過750cfu/g，夾心餅干菌落總數不得超過2000cfu/g;餅干產品的霉菌計數不得超過50cfu/g，超過國家標準規定可判斷為不合格餅干。 7、巴氏殺菌、滅菌乳的落菌總數標準 依據國家強制性標準GB19645-2005《巴氏殺菌、滅菌乳衛生標準》規定，滅菌乳菌落總數不得超過10cfu/g，大腸菌群不得超過3MPN/100g，超過國家標準規定可判斷為不合格乳制品。 8、蜜餞的落菌總數標準 依據國家強制性標準GB14884-2003《蜜餞衛生標準》規定，蜜餞食品中菌落總數不得超過1000cfu/g;霉菌不得超過50cfu/g，超過國家標準規定可判斷為不合格乳蜜餞產品。

1 培養基和試劑 平板計數瓊脂、75%乙醇、磷酸鹽緩沖稀釋液 2 操作程序 2.1 樣品制備 2.1.1以無菌操作取有代表性的樣品盛于滅菌容器內。如有包裝，則用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。 2.1.2制備樣品勻液 以無菌操作取25g樣品，放入裝有225ml稀釋劑的滅菌均質杯內，于8000r/min均質1-2min，制成1：10的樣品勻液。如樣品均質時間超過2min，應在均質杯外加冰水冷卻。 2.2 稀釋樣品勻液 2.2.1用10ml滅菌吸管準確吸取1：10的樣品勻液10ml，放入裝有90ml稀釋劑的150ml 稀釋瓶中。迅速振搖，將樣品混勻，制成1：100的樣品勻液。振搖時，幅度為30cm，7s內振搖25次。從容器中吸取樣品勻液和以后的稀釋操作中，吸管尖不要碰著瓶口。吸入的液體應先高于所要求的刻度，然后提起吸管使其尖端離開液面并貼在容器內壁將液體調至所要求的刻度。 2.3 平板接種 2.3.1對于每個樣品，選用合適的三個連續稀釋度的樣品液進行平板計數。 2.3.2分別用滅菌吸管吸取1ml樣品液放入作了適宜標志的平皿內。每個稀釋度的樣品液用兩個平皿。 2.3.3分別加12-15ml平板計數瓊脂(約45℃左右)到平皿內。立即將平皿內的樣品液和瓊脂培養基充分混合。要防止把混合物濺到平皿壁和蓋上。同時將平板計數瓊脂傾入加有1ml稀釋劑的另一滅菌平皿作空白對照。將樣品液加入平皿后應立即傾注瓊脂培養基，每個樣品從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用的時間不得超過20min。 2.4 培養 待瓊脂凝固后將平皿翻轉，立即放進36±1℃的恒溫培養箱培養48±2h。培養箱應保持一定的濕度，經48h培養的瓊脂培養基的失重不得超過15%。 2.5 菌落計數和記錄 2.5.1培養后，立即計數每個平板上的菌落數。25-250個菌落為合適范圍。如不能立即計數，應將平板存放于0-4℃，但不得超過24h。 2.5.2操作者對同一平板復核自己的計數結果，其差異應在5%之內，而其他人對這一平板重復計數，其差異應在10%這內。否則，應找出原因，加以校正。 2.6 計算和記錄數字：適宜稀釋度的兩個平板的菌落數平均值或兩個稀釋度的平板菌落數平均值乘以相應稀釋度倍數計算出每克(毫升)樣品中平板菌落數。 記錄時，只有在換算到每克(毫升)樣品中平板菌落數時，才能定下兩位有效數字，第三位數字采用四舍五入的方法記錄。也可將樣品的平板菌落數記錄為10的指數形式。 3 結果報告 報告每克(毫升)樣品中平板菌落數或估計的平板菌落數。 9.保存細菌的方法 1、細菌保存于穿刺培養物中：一般細菌保存于穿刺培養物可以維持兩年。具體方法：用滅菌接種針挑取分散良好的單菌落，針緩慢穿過瓊脂到達瓶底，連續幾次，蓋上瓶蓋擰緊，做好標記。室溫下存放于暗處。(最好一點可以將瓶蓋放松，在適當溫度下培養過夜，再擰緊瓶蓋并加封Parafilm膜，室溫或最好在4度避光保存)。 2、細菌保存于含有甘油的培養物中： (1)在液體培養基中生長的細菌培養物：取0.85ml細菌培養物，加入0.15ml高壓滅菌甘油，振蕩培養物使甘油分布均勻，然后轉移到標記好的保存管內，密封，在乙醇-干冰或液氮中凍結后再轉至-70度長期保存。在復蘇時，用滅菌接種針刮取凍結的培養物表面，然后立即把黏附于接種針上的細菌劃于含適當抗生素的LB瓊脂平板表面，于37度過夜。 (2)在瓊脂平板上生長的細菌培養物：從瓊脂平板表面刮下細菌放入裝有2mlLB的無菌試管內，再加入等量的含有30%滅菌甘油的LB培養基，振蕩使甘油完全分布均勻后，分裝于無菌保存管內，密封，再按前述方法冰凍保存。這一方法的優點在于可用于保存在質粒載體上建立的cDNA文庫。 如果甘油與培養基混合后凍存在一般冰箱的冰凍室里，不能反復復蘇使用，而且如果甘油含量太低，凍結成冰塊，復蘇效果不佳。一般都使用甘油終濃度為30%。

大腸埃希氏菌習慣稱為大腸桿菌，分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬，并且大腸桿菌株ATCC 11775是該屬的模式菌種。大腸桿菌的不同菌株間DNA相關性為80%，而與同科的志賀氏菌屬(除鮑氏志賀氏菌外)的DNA相關性可達80-87%。與人類疾病有關的大腸桿菌，統稱為致瀉性大腸桿菌(此名稱不易與致病性大腸桿菌相混淆)，一般包括五種：即腸毒素性大腸桿菌(ETEC)、致病性大腸桿菌(EPEC)、出血性大腸桿菌(EHEC)、侵襲性大腸桿菌(EIEC)和粘附性大腸桿菌(EAEC)。 　　二、生物學特性： 　　基本形態特征： 　　此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般大小約0.5μ-0.8μm*1.0μm-3.0μm,因生長條件不同，個別菌體可呈近似球狀或長絲狀。此菌多單獨存在或成雙，但不呈長鏈狀排列。約有50%左右的菌株具有周生鞭毛而能運動，但多數菌體只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動力弱;多數菌株生長有比鞭毛細、短、直且數量多的菌毛，有的菌株具有莢膜或微莢膜;不形成芽胞，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。 　　培養特征： 　　由于此菌合成代謝能力強，在含無機鹽、胺鹽、葡萄糖的普通培養基上生長良好。最適生長溫度為37℃，在42-44℃條件下仍能生長，生長溫度范圍為15-46℃。在普通營養瓊脂上生長表現3種菌落形態：(1)光滑型： 菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑、呈灰色，在生理鹽水中容易分散。(2)粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易在生理鹽水中自凝。(3)粘液型：常為含有莢膜的菌株。此菌兼性厭氧，在有氧條件下生長良好，最適生長pH為6.8-8.0，所用培養基pH為7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于8.0則生長緩慢。 　　生化反應與血清學反應 　　大腸桿菌屬于衛生學意義的大腸菌群和糞大腸菌群的范疇，因此，必須符合大腸菌群和糞大腸菌群的有關定義，在檢測大腸菌群、糞大腸菌群的基礎上，可以應用I(吲哚)、M(甲基紅)、Vi(3羥基-2-丁酮)、C(檸檬酸)即IMViC生化試驗對大腸桿菌作進一步鑒定，其IMViC結果為++--或-+--。生化反應是鑒定大腸桿菌的主要方法之一，然而，大腸桿菌之間生化反應的差異非常常見，象：許多菌種非/遲發酵乳糖，但并不說明它們遺傳上有明顯不同，生化反應非典型的大腸桿菌菌株與典型菌株的DNA相關性在85%-100%。附表1為大腸桿菌生化反應特性表。其中H2S、脲酶、阿糖酸、吲哚、ONPG試驗常為首選生化反應，其余為進一步的生化試驗。大腸桿菌在賴氨酸脫羧酶、粘質酸鹽、醋酸鹽生化試驗中，有一項或多項試驗陽性，且厭氧性生長弱，有動力和吲哚試驗陽性可與志賀氏菌相鑒別。 　　大腸桿菌的血清學反應，往往是對經分離、鑒定、確證為大腸桿菌的進一步分型，常不作為常規方法使用。附表2所列主要致瀉性大腸桿菌的血清型。對大腸桿菌的分型鑒定工作，基層檢驗單位若有要求時，可與各地所屬出入境檢驗檢疫局實驗室聯系，委托進行血清學鑒定工作。 　　三、大腸桿菌的抵抗力： 　　此菌對理化因素的抵抗力，在無芽胞菌中是最強的一種，在室溫可存活數周，在土壤、水中存活數月，耐寒力強，但是在30分鐘內快速冷凍，將37℃降至4℃的過程，可殺死此菌。加熱60℃，30分鐘，此菌可滅活。對漂白粉，酚、甲醛等較敏感，水中1ppb氯可殺死此菌。此菌耐膽鹽，在一定程度上能抵抗煌綠等染料的抑菌作用，在選擇性培養基配制上，常利用此菌這一性質。 　　四、衛生學意義與流行學 　　由于大腸桿菌是人及各種動物腸道中的正常寄居菌，常隨糞便從人及動物體排出，廣泛散播于自然界，所以一旦檢出大腸桿菌，即意味著直接或間接地被糞便污染，而在衛生學上被用于飲水，牛奶或食品等的糞源性污染衛生細菌學指標;并且由于大腸桿菌在外界存活時間與一些主要腸道病原菌相近，它的出現也可能預示著某些腸道病原菌(例：沙門氏菌、志賀氏菌)的存在，因此該細菌是國際上公認的衛生監測指示菌。近來，有些國家在執行HACCP管理中，將大腸桿菌檢測作為微生物污染狀況的監測指標和HACCP實施效果的評估指標。 　　致瀉性大腸桿菌是引起人體以腹瀉癥狀為主的全球性疾病，其中尤以EPEC、ETEC所占比例為大。附表3是我國部分省市主要腹瀉病原體檢出率情況，盡管目前報道各地主要腹瀉病是由志賀氏菌或輪狀病毒引起的，但是，多年來，致瀉性大腸桿菌引起的腹瀉病例始終位于第二位，可見大腸桿菌腸道傳染的廣泛性。還有，致瀉性大腸桿菌亦可常年引發人體腹瀉，以夏秋季為高峰，在患者感染住院率中，嬰幼兒占60%以上。近來，EHEC O157：H7為世界衛生組織(WHO)定為新的食源性致病菌，其引發的出血性腸炎的暴發或散發病例，自1983年以來在北美州(美國、加拿大)地區逐年增多，英國、日本亦有爆發和散發病例報道，我國也發現散發病例，尚未有爆發EHEC的報道。附表4為近幾年EHEC的污染狀況。 　　五、大腸桿菌檢驗程序圖解： 　　LST肉湯 　　37℃，48h 　　LST肉湯管陽性 (疑似大腸菌群)37℃，48h 　　EC肉湯　　44℃，24h　 　EC肉湯產氣管為陽性(糞大腸菌群) 　　陽性管再培養24h 　　EMB平板分離 　　37℃，24h黑色菌落移種營養瓊脂斜面 　　LST肉湯 　　　IMViC生化試驗　　　　革蘭氏染色 　　產酸產氣　　　++--/-+-- 　　　　　無芽胞G-桿菌 　　大腸桿菌 　　說明： 　　1、由于大部分致瀉性大腸桿菌在6℃條件中可失去活力，故大腸桿菌的定性檢測比定量檢測更適宜。如果確有大腸桿菌定量檢測要求的話，可用MPN法或終點稀釋法進行。 　　2、基層單位如有大腸桿菌生化鑒定要求或大腸桿菌血清學分型要求，可委托屬地出入境檢驗檢疫局進行檢驗。 　　3、檢測大腸桿菌的MUG法和膜過濾法，可參閱有關標準說明進行。 　　4、國標法與FDA方法，在所用培養基、檢驗程序上略有差異，但不影響大腸桿菌檢驗結果的準確性。

大腸菌群并非細菌學分類命名，而是衛生細菌領域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。