• 分類：公司新聞
• 發布時間：2021-01-13 16:18
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【概要描述】1 培養基和試劑 平板計數瓊脂、75%乙醇、磷酸鹽緩沖稀釋液 2 操作程序 2.1 樣品制備 2.1.1以無菌操作取有代表性的樣品盛于滅菌容器內。如有包裝，則用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。 2.1.2制備樣品勻液 以無菌操作取25g樣品，放入裝有225ml稀釋劑的滅菌均質杯內，于8000r/min均質1-2min，制成1：10的樣品勻液。如樣品均質時間超過2min，應在均質杯外加冰水冷卻。 2.2 稀釋樣品勻液 2.2.1用10ml滅菌吸管準確吸取1：10的樣品勻液10ml，放入裝有90ml稀釋劑的150ml 稀釋瓶中。迅速振搖，將樣品混勻，制成1：100的樣品勻液。振搖時，幅度為30cm，7s內振搖25次。從容器中吸取樣品勻液和以后的稀釋操作中，吸管尖不要碰著瓶口。吸入的液體應先高于所要求的刻度，然后提起吸管使其尖端離開液面并貼在容器內壁將液體調至所要求的刻度。 2.3 平板接種 2.3.1對于每個樣品，選用合適的三個連續稀釋度的樣品液進行平板計數。 2.3.2分別用滅菌吸管吸取1ml樣品液放入作了適宜標志的平皿內。每個稀釋度的樣品液用兩個平皿。 2.3.3分別加12-15ml平板計數瓊脂(約45℃左右)到平皿內。立即將平皿內的樣品液和瓊脂培養基充分混合。要防止把混合物濺到平皿壁和蓋上。同時將平板計數瓊脂傾入加有1ml稀釋劑的另一滅菌平皿作空白對照。將樣品液加入平皿后應立即傾注瓊脂培養基，每個樣品從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用的時間不得超過20min。 2.4 培養 待瓊脂凝固后將平皿翻轉，立即放進36±1℃的恒溫培養箱培養48±2h。培養箱應保持一定的濕度，經48h培養的瓊脂培養基的失重不得超過15%。 2.5 菌落計數和記錄 2.5.1培養后，立即計數每個平板上的菌落數。25-250個菌落為合適范圍。如不能立即計數，應將平板存放于0-4℃，但不得超過24h。 2.5.2操作者對同一平板復核自己的計數結果，其差異應在5%之內，而其他人對這一平板重復計數，其差異應在10%這內。否則，應找出原因，加以校正。 2.6 計算和記錄數字：適宜稀釋度的兩個平板的菌落數平均值或兩個稀釋度的平板菌落數平均值乘以相應稀釋度倍數計算出每克(毫升)樣品中平板菌落數。 記錄時，只有在換算到每克(毫升)樣品中平板菌落數時，才能定下兩位有效數字，第三位數字采用四舍五入的方法記錄。也可將樣品的平板菌落數記錄為10的指數形式。 3 結果報告 報告每克(毫升)樣品中平板菌落數或估計的平板菌落數。 9.保存細菌的方法 1、細菌保存于穿刺培養物中：一般細菌保存于穿刺培養物可以維持兩年。具體方法：用滅菌接種針挑取分散良好的單菌落，針緩慢穿過瓊脂到達瓶底，連續幾次，蓋上瓶蓋擰緊，做好標記。室溫下存放于暗處。(最好一點可以將瓶蓋放松，在適當溫度下培養過夜，再擰緊瓶蓋并加封Parafilm膜，室溫或最好在4度避光保存)。 2、細菌保存于含有甘油的培養物中： (1)在液體培養基中生長的細菌培養物：取0.85ml細菌培養物，加入0.15ml高壓滅菌甘油，振蕩培養物使甘油分布均勻，然后轉移到標記好的保存管內，密封，在乙醇-干冰或液氮中凍結后再轉至-70度長期保存。在復蘇時，用滅菌接種針刮取凍結的培養物表面，然后立即把黏附于接種針上的細菌劃于含適當抗生素的LB瓊脂平板表面，于37度過夜。 (2)在瓊脂平板上生長的細菌培養物：從瓊脂平板表面刮下細菌放入裝有2mlLB的無菌試管內，再加入等量的含有30%滅菌甘油的LB培養基，振蕩使甘油完全分布均勻后，分裝于無菌保存管內，密封，再按前述方法冰凍保存。這一方法的優點在于可用于保存在質粒載體上建立的cDNA文庫。 如果甘油與培養基混合后凍存在一般冰箱的冰凍室里，不能反復復蘇使用，而且如果甘油含量太低，凍結成冰塊，復蘇效果不佳。一般都使用甘油終濃度為30%。